引 言
目前，组织损伤修复存在多种修复方式，以中枢神经损伤为例，其修复研究策略有药物治疗、细胞移植、周围组织移植、基因治疗及联合治疗等方式。由于神经元的弱再生性，各种神经修复效果多不令人满意。尽管如此，经过长期深入的研究，在神经修复领域也取得一定的进展。相对于其他修复方式，干细胞以及嗅鞘细胞移植众多修复方式中最为引人注目，尤其是嗅鞘细胞被认为是治疗脊髓损伤最有前景的方法，其可以诱导神经轴突和髓鞘的再生，并引导再生的轴突通过胶质瘢痕区，最终形成突触，促进神经功能恢复；同时分泌的各种神经营养因子可以促进残存轴突芽生及传播能力，抑制胶质瘢痕形成，改善受损区的微环境。对于单纯的细胞注射移植，细胞不可避免的呈现四散性的排列生长，降低移植细胞的有效浓度，减弱了促进轴突和髓鞘再生能力，以及最终分化成有效神经样细胞的数量。因此，有必要限制移植细胞排列生长方向与神经走行方向一致，引导再生的轴突通过胶质瘢痕区与残存神经组织形成突触。一般认为，表面具有微观几何图案的支架材料通过“接触引导”作用可以有效增强细胞的增殖、取向性运动、迁移能力，以及诱导干细胞分化的作用。故深入研究细胞与具有拓扑结构材料间相互作用如细胞骨架和细胞黏附、增殖、极化、迁移和分化等功能，放大细胞的特殊生理效应，对于引导细胞定向修复创伤组织、增强修复效果有重要意义。
上个世纪四十年代，Weiss在首次提出了细胞在微纳米级的几何图案上的生长取向与几何图案走行方向趋于一致并沿图案运动、排列分布，但受限于微纳米制备技术以及组织工程学的发展，大量的实验研究还停留在猜想阶段。近数十年来，由于软印刷刻蚀、电纺、光电刻蚀、微纳米压印等新技术的出现，人们可以在不同生物材料表面制备达到纳米级的几何图案，使得人们能够在纳米尺度上探讨“接触引导”的精确调控作用。Feinberg等人对“接触引导”长期研究后认为拓扑结构对细胞行为的调控主要体现在材料表面的微观结构对细胞的生物调控以及材料表面的化学特征对细胞的生物调控，其中以材料表面微观结构对细胞调控最为重要。Colombo证实表面具有微观几何图案的材料，其材质的软硬程度对细胞同样具有调控作用。随后又报道材料表面的粗糙度与细胞的生物调控作用有着密切的联系。大量的研究报道后，国内外学者一致认为细胞能够感应材料表面的微观几何结构并做出相应生理应答，并影响其粘附、增殖、细胞形态、排列取向、迁移、凋亡、干细胞分化等生理效应。虽然大量实验结果证实了“接触引导’作用，但这些实验多是在二维环境下进行的，尚未见三维环境下的相关报道；且在人体三维环境与二维环境下，“接触引导”的是否具有相同的调控能力还需要进一步的研究。因此，本实验旨在体外模拟生物体的三维内环境，探讨二维以及三维环境下不同宽度的微观沟槽结构对细胞排列分布、迁移的影响，为日后的生物体内研究打下基础。
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前 言
1个世纪以前具有表面拓扑结构生物材料对细胞生理效应的影响就已被发现[1~3]，近年来随着微纳米生物学、组织工程学和医学研究的深入，人们开始注意到拓扑结构在人体组织修复的重要意义，尤其是在骨与脊髓等需要细胞相对定向性修复损伤的领域，正在形成以生物材料表面拓扑结构对细胞生理影响为方向的热点课题[4]。许多实验已经证实生物材料表面拓扑结构在二维结构中对细胞排列分布、生长、分化以及繁殖的调控能力[5~8]。特定的微观几何图案对细胞形状、生长运动以及取向排列具有明显的生物调控能力，同时微纳米材料可以显著增强细胞黏附、增殖能力，甚至诱导干细胞分化[9、10~12]，这些特殊的调控在组织修复领域有着重要意义，尤其对细胞取向性生长要求相对较高的组织如骨、脊髓损伤修复具有潜在应用价值。由于生物体内存在复杂的内环境系统，细胞接受体内外复杂因素的调节，如不同细胞间的相互影响、渗透压的影响、化学因素的影响、电磁环境以及重力场的影响，因此存在于生物体内的微观几何图案是否还具有与二维环境下相同的调控能力，是本实验的研究重点。但是限于生物材料学以及检测手段的限制，目前还无法在生物体内开展相关研究。因此，我们采用从大鼠尾部提取的纤维蛋白原凝胶包埋具有表面微米结构的聚二甲基硅氧烷(Poly di methyl siloxane, PDMS)，在体外模拟生物材料刚被植入生物体内时的三维内环境，探讨二维以及三维结构下不同宽度的微观沟槽结构对细胞排列分布、迁移的影响。
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材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验细胞
人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts，HDFs），脑神经胶质瘤细胞（brainglioma cells，BGCs）。HDFs、 BGCs分别来自腹部抽脂术中去掉的皮肤和脑神经胶质瘤，均得到患者书面同意，并明确告知标本将被用于研究。
1.1.2 具有表面沟槽结构的金属基底
利用电子束在金属表面灼刻出微米级水平沟槽结构，沟槽结构的高度均为20μm，宽度分别为12.5μm（Ⅰ组）、25μm（Ⅱ组）、50μm（Ⅲ组）及75μm（Ⅳ组），等离子氧清洗仪清洗1 min后烘干，干燥保存。
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1.2 试验方法 .....6
1.2.1 微纳米沟槽结构 PDMS 的制备 .........6
1.2.2 细胞培养......6
1.2.3 体外细胞试验 .........6
1.2.4 免疫染色......7
1.2.5 显微镜观察.........7
1.2.6 观察指标......8
3. 统计学分析 .........8
结 果
1 微纳米拓扑结构的表征
扫描电子显微镜(SEM)观察制备的PDMS表面沟槽图案（图-1）。所得沟槽结构均匀一致，热模压印过程中图案没有失真。但扫描电子显微镜观察只能大概测量沟槽图案的宽度，无法获取沟槽图案的深度数据。为了获得精确的图案几何参数，我们采用原子力显微镜表征了PDMS表面沟槽图案，证实各组沟槽凸起条纹宽度与凹槽宽度相一致，分别为12.5μm、25μm、50μm、75μm，沟槽深度均为10μm。观察周期内均可见实验组的两种细胞在PDMS上按照沟槽结构水平方向取向性生长；尤其以Ⅰ及Ⅱ组的细胞取向性分布更明显。对照组的细胞在PDMS上随机分布，无明显特异性（图-2）。实验二：各组细胞均能向水凝胶中生长。在PDMS上，组织学观察与实验一相似，实验组细胞均沿着沟槽结构水平方向取向性生长；以Ⅰ及Ⅱ组更明显。PDMS上方0～30μm范围内，细胞从PDMS上迁移入水凝胶中的过程中以及迁移进入水凝胶后的30μm，细胞仍呈水平取向生长排列。
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结 论
1.体外模拟生物体内环境可以成功建立稳定的细胞反应器。
2.模拟人体内环境下，在PDMS表面三维环境与二维环境具有相同的调控能力，微米级沟槽结构可促进细胞沿沟槽水平生长排列。
3.细胞水平排列的效率与沟槽宽度之间存在密切联系，沟槽越宽取向性排列效率越低。
4.三维环境中，细胞离开微观几何图案后，一定距离上仍受其影响，距离越远取向性影响越弱。
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参考文献（略）
15012858052
153688106
