奈达铂治疗恶性肺腺癌的医学研究

1 材料与方法

1.1 材料

本研究用 10μg/mL的NDP作用 48h后A549 细胞的bax表达上调，与前者报道一致。凋亡启动可分两个途径：线粒体途径（细胞内途径）和死亡受体途径（细胞外途径）。人肺腺癌细胞株A549 购自中国科学院上海细胞库；NDP购自南京东捷药业有限公司，批号：11-110101；RPMI1640培养基及100mL/L胎牛血清购自美国Hyclone公司；四氮甲唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒及细胞周期试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司。MK3 Multiskon型酶标仪购自美国Thermo Labsystems公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；梯度PCR仪（VeritiTM96）购自美国ABI公司；BIO-RAD凝胶成像系统购自美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞接种于 100mL/L胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，置 37℃、50mL/L CO2培养箱内培养。

1.2.2 MTT比色法 取对数生长期的A549 细胞，2.5g/L胰酶消化，制成 5×104/mL单细胞悬液，每孔 100μL，接种于 96 孔板。设对照组（加细胞、培养基）、加药组（加细胞、培养基、NDP）和调零组（只加培养基），每组设 5 个副孔。细胞贴壁后弃培养上清，每孔加新鲜培养基 180μL，NDP倍比稀释至 2.5、5、10、20、40μg/mL 5 个浓度。每孔加NDP 20μL，培养 48h。每孔加MTT (5mg/mL) 20μL，继续培养 4h，弃上清。每孔加DMSO 150μL，酶标仪上振荡溶解结晶，492nm波长检测吸光度值（A），计算A549 细胞的增殖抑制率。公式：抑制率=[1-（加药孔A-调零孔A）/（对照孔A-调零孔A）]×100%。用SPSS软件求出IC50，实验重复 3 次。

1.2.3 FCM检测细胞凋亡和周期 A549 细胞接种 6 孔板，设对照组，加药组（加药 10μg/mL作用 48h），胰酶消化，离心收集 1×105/mL个细胞，PBS洗两遍，加 500μL Buffer，5μLAnnexinⅤ，5μL PI，避光反应 15min，上机检测细胞凋亡；加RNA酶抑制剂100μL，37℃水浴30min，加PI 300μL，冰上避光反应30min，FCM检测细胞周期。

1.2.4 RT-PCR 检测基因表达 按 1.2.3 分组，加药组加 10μg/mL 作用 48h，按TRIZOL 试剂盒说明书提取总 RNA,紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度。逆转录合成 cDNA，进行PCR反应。Bax上游序列：AAGCTGATCGAGTGTCTCAAG，Bax下游序列：CAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC，产物长度178bp；Caspase3 上游序列：TTGTGGAATTGATGCGTGATGT，Caspase3下游序列：CATCCTTTGAATTTCGCCAAGA，产物长度 348bp；Caspase9 上游序列：TGTGAACTTCTGCCGTGAGTC，Caspase9下游序列： CATCCATCTGTGCCGTAGACA，产物长度264bp；GAPDH上游序列：TGGACCTGACCTGCCGTCTA，GAPDH 下游序列：GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA，产物长度149bp。反应条件：94℃预变性 3min，94℃变性 30s，退火 45s，72℃延伸 1min，反复扩增 35 个循环，72℃延伸 10min。退火温度：Bax 64℃，caspase-3 为60℃，Caspase-9、GAPDH 均 56℃。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察摄像。用 GAPDH 的灰度值进行校正后表示各目的基因的相对表达水平。

1.2.5 统计学方法 应用 SPSS16.0 软件行统计学处理。计量资料以 x±s 表示，各浓度 NDP 对 A549 细胞抑制率的比较用单因素方差分析；实验组和对照组比较用配对 t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NDP对A549 细胞增殖的影响和IC50

2.5、5、10、20、40μg/mL的NDP作用A549 细胞 48h，抑制率分别为（7.46±0.93）%、（15.30±1.04）%、（25.36±1.87）%、(61.06±3.18)%、(80.44±1.95)%，与对照组相比，均显示出抑制作用,差异有统计学意义（P均<0.05）。48h的IC50为 6.95μg/mL。随浓度增加，NDP的抑制作用逐渐增强（F=1268.42，P<0.05），呈浓度依赖性。

2.2 NDP 对 A549 细胞凋亡和周期分布的影响 分组同前，FCM 检测对照组细胞凋亡率为（8.01±1.46）%，加药组（10μg/mLNDP 作用 48h）凋亡率为（25.14±3.97）%，两组相比，差异有统计学意义（t=-9.23，P<0.05，图 1）。按以上条件处理细胞，加药组 G0/G1 期细胞比例减少（t=10.49，P<0.05），S 期比例增加，（t=-13.50，P<0.05），差异均有统计学意义，G2/M 期比例无明显变化（t=-0.175，P>0.05），细胞被阻滞在S期。

2.3 凋亡基因检测结果 A549 细胞的加药组 bax、caspase3、caspase9 mRNA 表达上调(表 2、图 3)，与对照组相比，差异有统计学意义（t=-7.673～-5.159，P<0.05）。 3 NDP 作用 48h 对 A549 细胞 bax、caspase-3、caspase-9 基因 mRNA 表达的影响Fig.3 Expressions of Bax, caspase3 and caspase9 gene mRNA in A549 cells after 48hour NDP treatmentM：Marker(分别为 100、200、300、400、500、600bp)；land 1、3、5、7：对照组；land 2、4、6、8：100μg/mL NDP 组。

3 讨 论

本研究观察到 2.5～40μg/mL 的 NDP 作用于人肺腺癌 A549 细胞 48h 后，活细胞数量减少，呈剂量依赖性。初步的体外实验提示 NDP 可以抑制 A549 细胞的增殖。
凋亡和细胞周期的失控与肿瘤的发生、发展及转归密切相关。诱导凋亡是许多抗肿瘤药物作用的机制之一。研究发现，10μg/mL的NDP作用 48h可以诱导A549 细胞发生明显的凋亡，流式细胞仪检测凋亡率较加药前明显增加，同时，细胞周期被阻滞在S期，与Risa Tanaka等运用NDP作用于人胃腺癌细胞株AZ-521 结果趋于一致，提示NDP能影响A549 细胞DNA的合成。同时钱军、秦叔逵等报道，顺铂、奥沙利铂、洛铂能将人肝癌细胞株Bel-7402 的细胞周期阻滞于S期，提示不同铂类药物对肿瘤细胞周期有相似的影响。
细胞凋亡是多种基因调控的结果。凋亡基因bax是bcl-2 基因家族的一员，在体内可与bcl-2 形成异源异构体，其作用是促进凋亡，对抗bcl-2 抑制细胞凋亡的活性，体内bax/bcl-2 比率上调在细胞凋亡信号传导中起重要作用。Bax的下调与肿瘤发生和对放化疗的敏感性相关。
报道NDP能上调人卵巢癌SKOV-3 细胞的bax的表达。线粒体途径可以在细胞内各种信号包括DNA损伤、各种应激的作用下引起前凋亡蛋白bax的活化，bax可降低线粒体膜电位，细胞色素C释放，诱导凋亡小体形成，启动caspase-9 的活化，进一步活化下游的caspase-3，从而引起级联放大反应，诱导细胞凋亡。无论是线粒体途径还是死亡受体途径，caspase-3 为两者的共同通路。由于caspase-3 位于级联反应的下游，其水平可以反映细胞凋亡的水平，是监测细胞凋亡的理想指标。本研究发现，10μg/mL的NDP作用 48h，A549 细胞的caspase-3 和caspase-9表达均上调。综上所述,bax、caspase-3 和caspase-9 的表达上调可能是NDP诱导A549 细胞凋亡的机制之一。
本研究观察到奈达铂在体外能抑制人肺腺癌 A549 细胞的增殖，诱导其凋亡，将其细胞周期阻滞在 S 期，并能上调凋亡基因 bax、caspase-3 和 caspase-9的表达，提示 NDP 对人肺腺癌有较好的抗癌效果，可以进一步通过体内实验证实。
NDP作为新一代铂类药物，优势在于肾毒性和对胃肠道的刺激较DDP小，在鳞癌的治疗效果上与DDP相近甚至优于DDP，主要的副作用为血液毒性，如中性粒细胞减少，贫血。NDP较低的肾毒性可能与其较好的毒物代谢动力学特性有关，如通过肾小管较快的排泄及在肾脏较少的蓄积等。目前没有因血液毒性导致死亡的报道，大多数病例的不良反应较轻而且是可逆的。NDP与DDP有不完全交叉耐药性，DDP治疗失败者还可能从NDP的治疗中获益。可见，奈达铂是一个高效低毒的化疗药，有可能成为治疗实体瘤的主要铂类药物，有很大的临床应用前景。

参考文献：
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