不同地理环境下樟子松遗传多样性研究

1引言

1.1立题依据
随着全球气候变暖和哥本哈根世界气候大会的召开，人们对生态环境的关注度持续上升。我国是一个地域辽阔的国家，但是在西北部地区很多地方水土流失严重，形成了很多干旱半干旱的沙地环境，这些环境中的森林生态十分脆弱，很多植物由于缺水干旱而不断减少。利用抗旱树种大规模造林是目前解决土壤沙漠化的一个有效途径。樟子松是一种耐寒耐旱的优良树种，利用樟子松进行大规模造林，不仅可以有效抵御土壤沙漠化的侵袭，还可以营造城市周边绿化景观，一举两得。樟子松sylvestnis var. mongolica Litv.)是欧洲赤松的一个变种，又多被称为海拉尔松（日）、蒙古赤松（日）、西伯利亚松、黑河赤松，属于松科大乔木。樟子松是我国东北地区主要优良造林树种之一，也是我国三北地区营造防护林的优良树种(解奇明等，1995)。它适应性强，生长快，树干通直，能抵御干旱和严寒的环境，在零下40-50度的低温下仍能生长（王淼与杨田，2008)。樟子松天然林主要分布于大兴安岭北部地区和呼伦贝尔草原上的沙地环境中。当然，樟子松最重要的还是其防风固沙的作用。从上世纪50、60年代开始，樟子松的引种驯化就在中国北方地区展开了。从大兴安岭地区延伸到内蒙古的库布齐沙漠，从晋蒙冀地区向西到达陕甘宁盆地，这些地区的樟子松引种造林都获得了成功(方攀等，2013)。辽宁省章古台沙地在中华人民共和国建国后最先引进栽培樟子松，现在己经是一片樟子松的林海，起到了很好的防风固沙效果，此外河北围场和陕西榆林毛乌素沙漠边缘地区引进的樟子松也长势良好，为局部地区防止沙漠化做出了贡献。在中国三北防护林（西北、华北、东北）的营造过程中，充分利用了北方部分地区樟子松引种造林的成功经验，使樟子松人工造林得到了跨越式发展，仅内蒙古地区樟子松人工林面积就达到了三北防护林总面积的三分之一，充分显示了樟子松在沙地干旱环境中重要的生态作用（李漠与薛斌，2010)。樟子松独特的抗旱抗风沙能力使其在市场上的经济价值日益凸显。随着十二五计划的开展，为了构筑首都北部地区生态屏障，内蒙古多伦县将种植百万亩的樟子松树苗，可见樟子松的需求量巨大。从2010年之后，逐年加重的雾霾天气也让北京及其周边的环境问题受到了广泛关注。2014年初，北京市表示将投入7600亿元治理大气污染，其中对城市绿化和周边生态环境的改善也将是重点。樟子松作为一种常绿植物，在冬季对空气的过滤净化是十分重要的，将在京津冀地区的大气治理中发挥应有的作用。所以，樟子松在经济价值和生态价值上，都有非常好的应用前景。
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1.2 SSR研究进展
本研究使用分子标记手段对樟子松的群体多样性进行研究。DNA分子标记技术最早能够追溯到20世纪80年代，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，大多数情况下DNA分子标记是以电泳图带的形式显示的，通过条带分离位置的不同来判断DNA片段的大小差异，所以也被称之为DNA指纹图谱（黄龙花等，2011)。DNA分子标记具有无法取代的优越性：首先，分子标记是以DNA的形式存在的，所以在生物的几乎每一个细胞内、每一个组织中或者生长的阶段中，都可以检测到这些标记，DNA标记不受气候环境的限制，也不会受到生物不同生长阶段是否表达的限制，在检测过程中很容易获得需要的标记。并且大多数DNA标记都是共显性的，符合孟德尔的遗传规则，能够很容易分辨出纯合体和杂合体；其次在生物生长的各个阶段，无论任何组织细胞只要含有基因组DNA，都可以用来作为标记使用，而且一些线粒体或者叶绿体DNA也可以作为标记使用(Provan etal.,1999),标记的选择灵活，数量众多，在基因组中的变异也非常丰富；最后分子标记揭示的是来自DNA的变异，不影响生物体目的性状的表达，检测方法也简单灵活，还可以确定特殊的性状位点变异。
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2樟子松EST-SSR引物的开发

2.1实验材料
本实验利用已经发表的油松转录组序列，蹄选出含有SSR位点的EST片段，然后将这些SSR位点应用在其近缘物种樟子松中，进行樟子松EST-SSR引物的蹄选。实验中用到的样本材料来自于围场樟子松的针叶样品。实验中用到的主要试剂和器材：Taq酶，10 X Taq Buffer (含Mg2+ )购自Tiangen公司，dNTP购自Promega公司。琼脂糖凝胶购自Biowest公司，DN在Marker购自艾德来公司(北京,中国)。樟子松EST-SSR引物根据油松的转录组EST序列设计而成，经过计算机初步蹄选确定使用效果较好的引物，由上海生工生物工程股份有限公司北京合成部合成。PCR 扩增反应在 Applied Biosystems 公司(Foster City, California, USA)的Veriti? Dx 96-Well Thermal Cycler仪器上进行。紫外分光光度计使用Amersham Biosciences公司的Ultrospec 6300pro仪器。聚丙炼酰胺凝胶电泳采用鸿涛基业公司(北京，中国)的HT-CX01型垂直电泳槽。6%聚丙炼酰胺凝胶：尿素420g，丙炼醜胺57g，甲叉双丙稀酰胺3g，Trisl0.8g，硼酸5.5g，0.5molEDTA4mL,加水定容至l000mL。使用滤纸避光过滤，4°C冰箱中保存备用。
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2.2实验方法
樟子松EST-SSR引物的开发分为三步进行。首先,从油松EST中筛选合适的SSR位点，并设计合适的引物。然后，对符合标准的引物进行条件优化，找到符合樟子松SSR引物的最适合PCR条件。最后，利用围场地区的樟子松样本进行樟子松EST-SSR引物的蹄选，选出具有多态性的引物。由于EST序列的拼接是随机的，所以测序中会出现重复情况，使用Phrap软件进行聚类和拼接，设定最小匹配碱基数为20，最小分值为40，从而得到无冗余的EST数据和尽可能长的重叠序列（贾捷，2011)。根据得到的EST序列，利用在线分析软件 SSRTOOL搜索 SSR 位点。SSR位点的蹄选标准为：单核苷酸，二核苷酸最少重复次数分别为12次，6次，三核苷酸，四核苷酸，五核苷酸和六核苷酸最少重复次数均为5次。所有位点的最小核苷酸重复不能少于12个。同时，剔除那些SSR位点位于序列两端或者离序列两端距离小于 40bp 的 SSR。
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3不同地理环境下樟子松的遗传多样性........ 25
3.1实验材料........ 25
3.2试验方法........ 26
3.3实验数据的统计分........ 28
3.3.1实验数据........ 28
3.3.2环境变量与EST-SSR多元回归分........ 30
3.4 讨论........30
3.4.1不同位点对群体多样性贡献不同........ 30
3.4.2榆林群体遗传多样性最高........ 31
3.4.3群体之间相对稳定，不容易分化........ 32
3.4.4遗传距离和地理距离正相关........ 33
3.4.5章古台群体不符合自然状态下的理想群体........ 35
3.4.6地理讳度是影响樟子松遗传变异的重要因素........ 35
3.5讨论........ 36
4 结论 ........41

3不同地理环境下樟子松的遗传多样性

3.1实验材料
实验过程中使用的樟子松样本材料来自于四个不同的地区，分别是红花尔基，榆林，章古台，围场（图3-1)。内蒙古红花尔基是樟子松天然林的分布地区，本实验采集该地区针叶样本40株。陕西榆林地区地处毛乌素沙漠边缘地带，属于干旱沙地类型，该地区是我国西北地区最早引种并获得成功的地区，本实验采集榆林红石峡地区1964年从红花尔基引种的樟子松样本40株，该区域樟子松目前长势良好。辽宁章古台地区以前处在号称“八百里激海”的科尔泌沙地最南端，也属于干旱沙地类型，但是新中国成立后经过几代人的固沙造林改造，建立了万顷防风固沙林，其中樟子松是主要树种，本实验采集掌故台地区样本30株。河北围场地区曾是著名的清代皇家猎苑，该地区水草丰美，自然环境优越，冬暖夏凉，物种资源十分丰富。樟子松作为一个人工引种树种，在该地区长势良好，形成了众多的苗木基地，本实验采集围场樟子松样本48株。具体信息见表3-1。以上材料采集后均使用液氮处理，然后冻存于冰箱内备用。其他材料请参考第二章的实验材料，在此不再重复说明。

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结论

本研究采用油松转录组数据开发出樟子松EST-SSR引物，并对樟子松的SSR反应体系进行了优化，得出了最佳反应体系，从中蹄选出了具有多态性的樟子松引物。首次利用EST-SSR分子标记的方法对樟子松不同群体的遗传多样性进行了系统全面的分析，阐明了樟子松群体间和群体内的遗传变异情况，并对不同地区的环境因素进行了相关性分析，得出了遗传变异与生态因素之间的关系。主要有以下几方面的结论：
1.共设计175对EST-SSR引物，其中有56对引物在樟子松中出现稳定、清晰和可重复的扩增产物，其他剩余引物因为扩增不稳定或者条带清晰度达不到要求而被舍弃。56对引物中有25对引物扩增出的位点具有多态性，其佘31对引物扩增出的位点没有多态性，多态性比例占总引物对的14%。
2.樟子松群体内遗传变异较大，群体间遗传变异较小。在四个群体内，只有榆林群体符合哈迪温伯格平衡，章古台群体连锁不平衡位点数最多。四个群体之间的遗传多样性情况：榆林群体>围场群体>章古台群体>红花尔基群体。
3.樟子松群体多样性与环境因素的关系不是很大，仅与炜度呈现显著的线性相关，经过分析认为这是地理隔离的作用，某群体离天然林群体红花尔基区域的距离越远，该群体的遗传变异与红花尔基群体遗传变异的差别就越大。
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参考文献（略）