第一章 绪 论
1 朊蛋白生理功能的研究进展
朊病毒病是一种由朊病毒导致的传染性神经退行性疾病，主要包括人的克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease，CJD）、致死性家族失眠症等和动物的传染性海绵样脑病[1]等。这些疾病都是由于细胞中PRNP基因编码的正常细胞型朊蛋白（cellular isoform of prionprotein，PrPC）转变为异常的痒病型朊蛋白（scrapie isoform of prion protein，PrPSc）所致。当PrPSc序列中富含β折叠的区域与PrPC结合后会使后者构象转变为PrPSc，从而发生无核酸感染[1,2]。由于这种构象转换和随后的异常都需要PrPC的存在，因此当不存在内源性PrPC时，PrPSc就不再具有传染性和神经毒性[3]。在新变型和零星的克雅氏病患者和一些传染性海绵样脑病动物体中已经证明朊病毒不仅在中枢神经系统积累，而且也存在于淋巴器官[4]。新的研究发现，对于朊病毒在细胞间转移中细胞通讯隧道小管（tunneling nanotubes，TNTs）是十分重要的[5]。最新报告指出，在基质细胞的炎性肉芽肿中朊病毒的复制依赖于淋巴毒素[6]。不仅PrPSc的致病过程仍存在诸多疑问，对于PrPC正常功能的研究也不完全。目前已知哺乳动物的PrPC有多种功能，它不仅参与细胞的代谢、粘附[8]、分化和凋亡，还参与了细胞金属离子转运[7]、跨膜信号转导[9]、氧化应激和免疫调节等过程。近期多篇外文文献对不同朊病毒病的致病通路和表型变异进行了综述[4,10-12]。最新研究表明，PrPC不仅在神经系统起着基本的作用，还可能参与人类癌症细胞的抗细胞凋亡、扩散和转移等过程。PrPC广泛存在于多种物种中[4]，首次对PrPC基因敲除小鼠的研究[13]表明，PrPC与小鼠的神经系统功能密切相关。然而，PrPC确切的生物功能远不止如此，除了与神经系统功能相关外，许多敲除或高表达PrPC转基因小鼠的研究发现，PrPC不仅在神经系统中发挥重要作用，还在其他器官中参与许多生物过程。
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2 PI3K/Akt 信号转导通路的研究进展
20 世纪 80 年代初期，在尝试阐明胰岛素受体信号时发现受体酪氨酸激酶（receptort yrosine kinases，RTKs）可识别与激活 PI3K/Akt 通路[45-46]。在研究 PI3K/Akt 通路对于肿瘤发生作用的同时，也发现了该途径的负调控物，如蛋白磷酸酶 2（protein phosphatase 2，PP2A）、 蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）、PH-结构域富重复亮氨酸蛋白磷酸酶（PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase， PHLPP1/2）。PI3K/Akt通路作为高度保守的一条途径，它的激活受着多过程的严格调控（图 1-1）。激活的受体通过其调节亚基或其他相关分子，如胰岛素受体底物（insulin receptorsubstrate，IRS）蛋白，可直接作用于一级 PI3Ks，PI3K 激活后其催化区可转换为 3,4-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphat idylinositol 3,4-bisphosphate，PIP2）、3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatid ylinositol 3,4,5-trisphos-phate，PIP3）。Akt与 PIP3 在质膜上结合后，磷脂酰激酶 依 赖 激 酶 1（phosphatid ylinositol dependent kinase，PDK1）便作用于Akt 使其磷酸化[47]，通过 mTOR[48]或 DNA-PK[49]磷酸化Akt Ser473的羧基疏水端激活Akt。Akt 介导许多细胞功能，包括血管生成、新陈代谢、生长增殖、蛋白质合成、转录和细胞凋亡(图 1-2）。
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第二章 鸡Akt基因mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量 RT-PCR 检测法建立
Akt 又称 PKB，即蛋白激酶 B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。Akt 是原癌基因 c-akt 的表达产物，它参与生长因子激活的经 PI3K 介导的信号过程，可以在多种生长因子、细胞因子、激素的激活作用下或者 PTEN 的失活刺激其活化。Akt 活化后，能够激活细胞的抗凋亡机制，调节蛋白合成及葡萄糖代谢等过程，进而在抑制细胞凋亡的同时，促进细胞的生长与增殖。因此，调节 Akt 基因表达可改变细胞增殖与凋亡的平衡，达到抑制肿瘤生长的目的。蛋白激酶 Akt 作为磷脂酰肌醇-3 激酶的下游分子，广泛参与细胞各种功能调节。实时荧光定量 RT-PCR 技术，即将荧光基团掺入到 PCR 反应体系中，通过荧光信号的积累来实时监测整个 PCR 进程，是当前检测基因转录的最灵敏和准确的方法之一[107-109]。其中 SYBR GreenⅠ荧光染料法以成本低、方便等优点而被广泛使用。目前国内外尚无针对鸡 Akt 基因的荧光定量 PCR 检测方法。为快速检测鸡细胞增殖能力，本章利用 SYBR GreenⅠ实时定量 RT-PCR 技术，建立了鸡 Akt（chAkt）基因 mRNA 的定量分析方法。
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2 结果与分析
以 DF-1 细胞 cDNA 为模板分别用特异性引物 PCR 扩增目的基因 Akt 和 β -actin，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出与预期片段大小（Akt 基因 175bp，β -actin 基因 190bp）相符的产物（图 2-1）。经凝胶回收纯化的 Akt 和 β -actin 基因扩增产物与 pMD18-T 连接、转化 E.coli DH5α 后，筛选阳性克隆并经 PCR 鉴定，获得疑似重组质粒 pMD 18-Akt、pMD18-β -actin（图 2-2)，经测序和 BLAST 分析表明，重组质粒的目的基因核苷酸序列与GenBank 中注册的鸡 Akt 和 β-actin 的同源性达 100%，即目的基因克隆成功。取 10 倍梯度稀释的鸡 Akt 和 β -actin 基因 pMD 18-Akt、pMD 18-β -actin 的重组质粒标准品，分别进行 RT-PCR 扩增，建立了以目的基因拷贝数的对数值为横坐标、Ct 值为纵坐标的 RT-PCR 标准曲线（图 2-3 和 2-4），Akt 基因标准曲线表达式为 y＝－3.437x＋42.78，β -actin 基因标准曲线表达式为 y＝－3.506x＋44.18。针对鸡 Akt 和 β -actin 基因的 RT-PCR 标准曲线的线性范围均达到 107，检测的重组质粒浓度分别在 2.41×104～2.41×1010和 4.21×104～4.21×1010拷贝/μL 之间，得到扩增动力学曲线，不同浓度的质粒模板随循环数的增加，其荧光强度逐渐增强。扩增反应灵敏度均为 104copies/μL。其对数与相应 Ct 值（循环阈值）均具有良好的相关性，决定系数（R2）分别为 0.9773 与 0.9513，并由 Roche LightCycler480Ⅱ计算出反应的扩增效率分别为 94.06%和 92.85%。
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第三章 渥曼青霉素对鸡DF-1细胞与朊蛋白过表达DF-1细胞增殖....... 19
1.1 材料 ..... 19
1.1.1 细胞 ..... 19
1.1.2 主要试剂 .... 19
1.1.3 主要仪器 .... 19
1.2 方法 ..... 20
2 结果与分析 ....... 21
2.1 渥曼青霉素以剂量依赖方式抑制 DF-1 细胞粘附......... 21
2.2 渥曼青霉素以剂量依赖方式抑制 DF-1 细胞侵袭......... 24
2.3 渥曼青霉素以剂量和时间依赖方式抑制 DF-1 细胞增殖.... 25
2.4 渥曼青霉素以剂量依赖方式促进 DF-1 细胞凋亡 ........ 26
2.5 不同渥曼青霉素浓度下 PrPC基因的表达差异分析...... 30
3 讨论..... 30
3 讨论
PrPC通过表达量、交联形式和与相关蛋白的互作等方式参与多个信号途径的调节，如PI3K/Akt、环 腺 苷 酸 / 蛋 白 激 酶 A（ PKA ）、 蛋 白 激 酶 C（PKC）、Fyn和Erk1/2等途径。PrPC在活细胞中参与调节增殖、分化、细胞粘附、细胞转运和跨膜等多个胞内信号通路。Akt 是在人类癌症最常见的蛋白激酶，Akt 的活性与抗细胞凋亡以及细胞生长、增殖和能量代谢有关。在肿瘤细胞中 Akt 的表达量较正常细胞高，有加速细胞增殖和抑制细胞程序性死亡的作用。因此，抑制 Akt 的活性一直被视为一个有吸引力的干预治疗肿瘤的方法。然而，逐渐发现 Akt致癌基因也可以防止肿瘤细胞转移。在人类乳腺癌细胞中超表达磷酸化 Akt 活性，从而目标肿瘤结节性硬化症 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）降低，减少肌动蛋白纤维粘连，降低肿瘤细胞运动性和转移。激活 Akt 可改变细胞迁移和侵袭，活跃的 Akt 可以提高癌症细胞侵袭能力，但 Akt 还可以在正常细胞上产生相反的效果。在一项研究中发现，磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatid ylinositol 3-kinase，PI3K）的激活通过增加 Rac1 的活性，并刺激 Akt 表达量的升高，促进细胞增殖，从而扰乱了正常的组织极性。本实验显示，ChPrPC在 DF-1 细胞中的大量表达与促进该细胞增殖、粘附和侵袭，抑制细胞凋亡等过程相关。加入 PI3K 抑制剂渥曼青霉素后，能显著抑制细胞增殖、粘附和侵袭并诱导细胞凋亡，且作用与药物浓度呈正相关。流式细胞仪凋亡率的检测证实，细胞增殖、粘附和侵袭受抑制可能与渥曼青霉素诱导的细胞凋亡有关，且当低浓度时诱导凋亡能力不明显，但随渥曼青霉素浓度加大凋亡率明显增加。
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结 论
1. Akt基因的表达量与PRNP的表达量密切相关，提示ChPrPC可能参与了Akt的激活，并且Akt对PrPC可能存在反馈调节。
2. ChPrPC参与DF-1细胞增殖、粘附、侵袭与凋亡的过程，可促进DF-1细胞的增殖、粘附和侵袭，抑制DF-1细胞的凋亡。
3. 加入PI3K/Akt信号转导通路的抑制剂渥曼青霉素后，可明显抑制DF-1细胞的增殖、粘附和侵袭，并促进DF-1细胞凋亡，且作用于药物浓度呈正相关。相比正常的DF-1细胞，DF-1-PrP细胞受到渥曼青霉素（浓度低于50nmol/L）的影响较小，这说明过表达的PrPC还可通过其他途径调节DF-1细胞的增殖、粘附和侵袭的能力。
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参考文献（略）
15012858052
153688106
